13/12/2018 16:12 - Xem: 2872

Nghiên cứu quy trình tách chiết Asiaticoside từ cây ngũ gia bì chân chim

Mục đích của nghiên cứu là khảo sát đơn yếu tố nhiệt độ sấy, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu, nồng độ dung môi ethanol, ảnh hưởng tới quá trình tách chiết asiaticoside từ vỏ cây ngũ gia bì chân chim cho kết quả tương ứng: 80 ¬0¬C ; 15/1 (v/w); 80%. Trên cơ sở khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến điều kiện chiết tách, chúng tôi nhận thấy nhiệt độ sấy, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu, nồng độ dung môi là những yếu tố ảnh hưởng mạnh đến quá trình chiết tách. Bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm Box- Behnken đã tìm được điều kiện tối ưu quá trình tách vỏ cây ngũ gia bì chân chim ở nhiệt độ sấy 79,52°C, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu 17,51/1 (v/w), ethanol 79,42%, hàm lượng asiaticoside là 0,0545%. Kết quả thực nghiệm cho kết quả có độ tương thích cao với mô hình. Từ khóa: ngũ gia bì chân chim, asiaticoside, tách chiết, tối ưu, Box- Behnken.

MỞ ĐẦU

Chân chim ( là chi lớn nhất, có thành phần loài rất đặc sắc, đa dạng; hiện đã thống kê được khoảng 56 loài (chiếm 39,7% tổng số loài của cả họ) và 4 thứ, trong số đó có tới 40 loài (chiếm 71,2% số loài trong chi, hay 28,4% tổng số loài của cả họ) là đặc hữu. Đây thực sự là nguồn tài nguyên chứa các hợp chất tự nhiên rất phong phú và có nhiều tiềm năng ở Việt Nam [3], ngũ gia bì chân chim mọc hoang ở nhiều tỉnh miền bắc nước ta [2].

Chân chim có một số tác dụng dược lý: Tăng lực, chống lạnh, hạ đường huyết, kiểu oestrogen, ảnh hưởng đối với thuốc gây ngủ. Ngoài ra, chân chim còn được kết hợp với dược liệu khác để chữa: Phong thấp đau xương, bệnh cước khí, chân sưng đau, chân tê buốt sưng đau, da lở ngứa do thấp nhiệt [4].

Cây ngũ gia bì chân chim là một loại cây dễ kiếm trong tự nhiên và được sử dụng với nhiều công dụng khác nhau. Trong vỏ thân của cây ngũ gia bì chân chim có chứa asiaticoside

siaticoside và scheffoleoside B được phân lập từ vỏ thân cây Schefflera heptaphylla [5].

Asiaticoside là 1-O-acyl-D-glucose pyranose được tìm thấy trong tự nhiên. Asiaticoside có khả năng kháng khuẩn và hoạt tính diệt
nấm chống lại được mầm bệnh và nấm, asiaticoside còn có khả năng đuổi muỗi hiệu quả Vì vậy asiaticoside được sử dụng nhiều trong lĩnh vực dược phẩm.

Việc tách chiết asiaticoside chịu ảnh hưởng bởi dung môi, điều kiện chiết. Vì vậy mục đích của nghiên cứu là nhằm tối ưu hóa quá trình tách chiết asiaticoside tổng số từ vỏ cây ngũ gia bì chân chim tại trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, tỉnh Thái Nguyên.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Vật liệu nghiên cứu

Vỏ cây ngũ gia bì chân chim (Schefflera heptaphylla) được thu hái tự nhiên tại trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, xã Quyết Thắng, thành phố Thái Nguyên, tỉnh Thái Nguyên.

Nguyên liệu được rửa sạch, sau đó đem đi sấy ở nhiệt độ 80℃ đến độ ẩm dưới 10%, tiến hành bảo quản trong túi PE đặt trong hộ nhựa kín, lưu trữ ở nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng và ẩm.

Dung môi: Dùng dung môi ethanol (dạng tinh khiết – Việt Nam).

Bố trí thí nghiệm

Asiaticoside được chiết từ vỏ cây ngũ gia bì chân chim bằng dung môi ethanol 50, 60, 70, 80, 90% (v/v). Nhiệt độ sấy là 60, 70, 75, 80, 85⁰C trong các khoảng thời gian 3 h, 4 h, 5 h, 6 h với tỷ lệ dung môi: nguyên liệu lần lượt là 10:1; 15:1; 20:1 (v/w). Sau khi tiến hành khảo sát các đơn nhân tố, chúng tôi lựa chọn 03 yếu tố là các yếu tố ảnh hưởng lớn nhất đến hàm lượng asiaticoside tổng số trong vỏ cây ngũ gia bì chân chim, để đánh giá khả năng ảnh hưởng của chúng, chúng tôi sử dụng phương pháp bề mặt chỉ tiêu theo thiết kế thí nghiệm của Box – Behnken với ba yếu tố, ba cấp độ.

Xác định hàm lượng asiaicoside tổng số

Cân 3 g bột vỏ cây ngũ gia bì chân chim cho vào giấy lọc buộc kĩ để tránh bột rau chảy ra ngoài. Sau đó cho gói bột vào phần thân của bình soxhlet, còn dung môi cho khoảng 250 ml vào bình cầu bên dưới rồi tiến hành tách chiết ở nhiệt độ sôi của dung môi. Sau khi chiết xong phần dịch chiết sẽ được cho vào bình tam giác, rồi tiến hành lọc thô, lọc tinh. Cuối cùng dịch chiết được chứa trong eppendorf đem đi phân tích sắc kí. Đánh dấu mức dịch chiết ở bình tam giác và xác định thể tích dịch chiết. Hàm lượng asiaticoside (X) của mẫu sẽ được tính dựa vào nồng độ của asiaticosdie chuẩn thông qua diện tích peak chuẩn và diện tích peak ghi nhận được của mẫu công thức sau: [1]

Trong đó:

S_as: Diện tích peak của Asiaticoside chuẩn

S_m: Diện tích peak của Asiaticosdie mẫu

A: Nồng độ mẫu Asiaticoside chuẩn (mg/ml)

K: Thể tích của dịch chiết Asiaicoside (ml).

Phương pháp xử lý số liệu

Số liệu nghiên cứu được xử lý bằng phần mềm xử lý số liệu SPSS 18.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Ảnh hưởng của nồng độ ethanol

Từ kết quả bảng 1 cho thấy khi chiết ở nồng độ khác nhau thì sẽ cho hàm lượng asiaticoside khác nhau và hàm lượng asiaticoside bắt đầu tăng lên khi chiết ở nồng độ từ 50% đến 70%. Hàm lượng asiaticoside đạt cao nhất tại nồng độ ethanol 80% tương ứng với hàm lượng asiaticoside 0,037%. Tiếp tục tăng nồng độ ethanol lên 90% thì hàm lượng asiaticoside không tăng. Do vậy, nồng độ ethanol 80% là thích hợp nhất để thực hiện quá trình tách chiết asiaticoside từ vỏ cây ngũ gia bì chân chim.

Bảng 1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến hàm lượng asiaticoside của vỏ cây ngũ gia bì chân chim

CT	Nồng độ (%)	Hàm lượng asiaticoside (mg/100 g)
CT1	50	0,027^b ± 0,002
CT2	60	0,028^b ± 0,002
CT3	70	0,030^b ± 0,002
CT4	80	0,037^a± 0,001
CT5	90	0,036^a ± 0,001

Ghi chú: Trên cùng 1 cột các giá trị mang cùng chữ số mũ thì khác nhau không có ý nghĩa ở mức α = 0,05

Ảnh hưởng của thời gian chiết

Từ bảng 2 ta thấy thời gian tách chiết có ảnh hưởng đến quá trình chiết tách asiaticoside từ nguyên liệu vỏ cây ngũ gia bì chân chim. Ta có thể nhận thấy hàm lượng asiaticoside tăng khi tăng thời gian chiết từ 3 h đến 4 h. Tuy nhiên khi tăng thời gian chiết lên 5 h thì có hàm lượng bị giảm từ 0,040% xuống 0,036%. Tiếp tục tăng thời gian chiết lên 6 h thì hàm lượng asiaticoside tiếp tục giảm từ 0,040% xuống 0,035%. Khi chiết ở thời gian là 4 h thì cho hàm lượng asiaticoside là cao nhất, vì vậy chúng tôi chọn thời gian chiết thích hợp là 4 h.

Bảng 2. Ảnh hưởng của thời gian chiết

CT	Thời gian chiết (giờ)	Hàm lượng asiaticoside (%)
CT1	3 h	0,036^b ± 0,001
CT2	4 h	0,040^a ± 0,002
CT3	5 h	0,036^b ± 0,002
CT4	6 h	0,035^b ± 0,002

Ghi chú: Trên cùng 1 cột các giá trị mang cùng chữ số mũ thì khác nhau không có ý nghĩa ở mức α = 0,05

Ảnh hưởng nhiệt độ sấy

Từ kết quả bảng 3 cho thấy nhiệt độ sấy là yếu tố ảnh hưởng tới hàm lượng asiaticoside tổng thu được sau quá trình chiết. Từ bảng 3 ta có thể thấy hàm lượng asiaticoside tăng đều khi tiến hành tăng nhiệt độ từ 60⁰C đến 80⁰C. Hàm lượng tăng cao từ 0,037% lên 0,048%. Tuy nhiên, khi tiếp tục tăng nhiệt độ lên 85⁰C thì hàm lượng asiaticoside có xu hướng giảm. Hàm lượng asiaticoside thu được cao nhất khi chiết ở 80⁰C. Vì vậy nhiệt độ sấy thích hợp là 80⁰C.

Bảng 3. Ảnh hưởng của nhiệt độ sấy

CT	Nhiệt độ (°C)	Hàm lượng asiaticoside (%)
CT1	60	0,037^c ± 0,001
CT2	70	0,040^b ± 0,002
CT3	75	0,041^b ± 0,002
CT4	80	0,048^a± 0,002
CT5	85	0,042^b ± 0,001

Ghi chú: Trên cùng 1 cột các giá trị mang cùng chữ số mũ thì khác nhau không có ý nghĩa ở mức α=0,05

Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu

Từ bảng 4 cho thấy tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu có ảnh hưởng tới hàm lượng asiaticoside được chiết từ vỏ cây ngũ gia bì chân chim. Hàm lượng asiaticoside trong dịch chiết tăng lên khi tỷ lệ: dung môi/ nguyên liệu tăng. Từ tỷ lệ 10/1 đến 15/1, hàm lượng asiaticoside tăng nhanh nhưng từ tỷ lệ 15/1 đến 20/1 thì hàm lượng asiaticoside lại tăng chậm. Đạt hàm lượng asiaticoside cao nhất 0,055% ở tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu là 20/1. Tuy nhiên hàm lượng asiaticoside ở công thức tỷ lệ 15/1 và 20/1 sự sai khác không có ý nghĩa thống kê. Vì vậy chúng tôi chọn tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu thích hợp là 15/1 để tiết kiệm dung môi.

Bảng 4. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu

CT	Tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu (ml/g)	Hàm lượng asiaticoside (%)
CT1	10/1	0,048^b ± 0,002
CT2	15/1	0,054^a ± 0,002
CT3	20/1	0,055^a ± 0,002

Tối ưu hóa quá trình tách chiết

Chúng tôi sử dụng phương pháp bề mặt chỉ tiêu theo thiết kế thí nghiệm của Box- Behnken với ba biến ba cấp độ. Các số liệu thu được từ dịch chiết vỏ cây ngũ gia bì chân chim được xử lý trên phần mềm Design- Expert 7.0 (Stat-Ease Inc, Minneapolis, USA) ANOVA được dùng để đánh giá kết quả thu được. Tiến hành giải bài toán tối ưu theo phương pháp “hàm mong đợi”. Sử dụng phần mềm Design-Expert 7.0 để tiến hành tối ưu hóa nhằm xác định được giá trị của ba yếu tố mà tại đó hàm lượng asiaticoside là cao nhất. Áp dụng phương pháp phân tích hồi quy các số liệu thực nghiệm, thu được mô hình đa thức bậc hai thể hiện hàm lượng asiaticoside: Y= +0,054 – 1,375*10^-3*A + 8,75*10^-4*B – 1,25*10^-3*C – 7,5*10^-4*A*B + 9,5 *10^-3*A*C - 5*10^-4*B*C – 0,012 A² – 9,75*10^-4*B² – 0,021*C²

Trong đó Y là hàm lượng asiaticoside trong dịch chiết dự báo thu được.

Bảng 5. Ma trận thực nghiệm Box- Behnken ba yếu tố chiết asiaticoside từ vỏ cây ngũ gia bì chân chim

TN	Biến thực			Hàm lượng asiaticoside (%)
TN	A (nhiệt độ sấy)	B (dung môi/ nguyên liệu)	C (nồng độ ethanol)	Hàm lượng asiaticoside (%)
1	75	10/10	80	0,040
2	85	10/10	80	0,041
3	75	20/1	80	0,043
4	85	20/1	80	0,041
5	75	15/1	70	0,035
6	85	15/1	70	0,011
7	75	15/1	90	0,013
8	85	15/1	90	0,027
9	80	10/1	70	0,032
10	80	20/1	70	0,035
11	80	10/1	90	0,031
12	80	20/1	90	0,032
13	80	15/1	80	0,054
14	80	15/1	80	0,053
15	80	15/1	80	0,055
16	80	15/1	80	0,055
17	80	15/1	80	0,054

Để đánh giá mô hình chúng tôi sử dụng phân tích ANOVA. Kết quả phân tích ANOVA được thể hiện qua bảng sau:

Bảng 6. Phân tích phương sai ANOVA của mô hình chiết asiaticoside từ vỏ cây ngũ gia bì chân chim

Nguồn	SS	DF	MS	Chuẩn F	Giá trị p
Model	60,47	9	6,72	105,14	< 0,0001
A	2,07	1	2,07	32,40	0,0267
B	0,25	1	0,25	3,89	0,0485
C	1,04	1	1,04	16,22	0,0386
AB	0,093	1	0,093	1,46	0,0671
AC	1,39	1	1,39	21,79	<0,0001
BC	0,032	1	0,032	0,51	0,0956
A²	3,21	1	3,21	50,30	<0,0001
B²	4,16	1	4,16	65,07	0,0364
C²	44,64	1	44,64	698,63	< 0,0001
Residual	0,45	7	0,064
Lack of Fit	0,32	3	0,11	3,52	0,0743
Sai số (pure error)	0,12	4	0,031
SS tổng Số	60,91	16

SS: Tổng phương sai; DF:Bậc tự do; MS: Trung bình phương sai; Chuẩn F: Chuẩn Fisher; Residual: Phần dư; “Lack of Fit”: Chuẩn đánh giá độ không tương thích của mô hình với thực nghiệm.

Từ kết quả phân tích ANOVA ta thấy giá trị xác suất của mô hình P-value = 0,0001<0,05 do đó mô hình được lựa chọn để giải thích cho kết quả của thí nghiệm, Lack of fit test = 0,0743 (not significant) có ý nghĩa đối với mô hình.

Hình 1. Bề mặt đáp ứng hàm lượng asiaticoside

a. Mô hình tương tác giữa tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu và nhiệt độ b. Mô hình tương tác giữa nồng độ và tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu c. Mô hình tương tác giữa nồng độ và nhiệt độ

Phương án tốt nhất được dự đoán nhiệt độ sấy 79,52°C, tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu 17,51/1 (v/w), nồng độ ethanol 79,42% khi đó hàm lượng asiaticoside đạt 0,0545%. Kết quả kiểm tra bằng thực nghiệm cho kết quả tương ứng

Hình 2. Hàm kỳ vọng và điều kiện tối ưu ở hàm lượng asiaticoside

KẾT LUẬN

Điều kiện tách chiết thích hợp để thu được hàm lượng asiaticoside được xác định như sau: Nhiệt độ sấy 80⁰C, tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu 15/1 (v/w), nồng độ ethanol 80%. Chúng tôi sử dụng phương pháp bề mặt chỉ tiêu theo thiết kế thí nghiệm của Box- Behnken với ba biến ba cấp độ cho phương án tốt nhất được dự đoán nhiệt độ sấy 79,52°C, tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu 17,51/1 (v/w), nồng độ ethanol 79,42% khi đó hàm lượng asiaticoside đạt 0,0545%. Kết quả kiểm tra bằng thực nghiệm có độ tương thích cao.

Kết quả của chúng tôi chỉ ra tiềm năng sử dụng vỏ cây ngũ gia bì chân chim trong dược phẩm.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Nguyễn Thị Vân Anh (2012), Nghiên cứu điều kiện chiết tách asiaticoside từ rau má và ứng dụng sản xuất trà chức năng từ rau má, Luận văn thạc sĩ Kỹ thuật công nghệ thực phẩm và đồ uống, Trường Đại học Đà Nẵng.

2. Đỗ Tất Lợi (2004), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nxb Y học.

3. Lã Đình Mõi, Châu Văn Minh, Trần Văn Sung và cs (2013), “Họ nhân sâm (araliaceae Juss.) nguồn hoạt chất sinh học đa dạng ở Việt Nam”. Hội nghị khoa học toàn quốc về sinh thái và tài nguyên sinh vật lần thứ 5, Hà Nội ngày 18/10/2013, Nxb Nông nghiệp, tr. 1153- 1157.

4. Nguyễn Tấn Phát (2016), Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của lá Schefflera Sessiliflora De P. V. Thuộc họ ngũ gia bì (Araliaceae), Luận án tiến sĩ hóa học, Học viện khoa học và công nghệ.

5. Chun Wu, Ying-Hiu Duan, Man Meo Li (2013), “Triterpenoid Saponins from the stem barks of Scheffera Heptaphylla”, Phytochemistry, pp. 1348- 1352.

Người viết: ThS.Lưu Hồng Sơn

CÁC BÀI VIẾT CÙNG CHUYÊN MỤC

Đang online	685
Hôm nay	1720
Hôm qua	1474
Tuần này	21573
Tuần trước	32159
Tháng này	3772501
Tháng trước	4969151
Tất cả	48186677